阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是最常见的神经退行性疾病，与认知功能的进行性下降有关。大量研究表明，肠道微生物群通过微生物-肠道-脑”轴调节宿主大脑功能和行为。黄精作为一种传统的滋补草药，在中国已有数千年的历史，具有促进记忆、延年益寿的作用。其中，黄精多糖（Polygonatum sibiricum polysaccharides，PSPs）具有滋补神经和益智的作用。前期研究已经表明，PSPs可以通过Akt/mTOR和Nrf2途径保护MPP诱导的神经毒性，在预防帕金森病方面具有滋补神经的作用。然而，到目前为止，还没有研究能确定PSPs对AD认知功能的影响及其潜在的机制。 

为了探索PSPs对肠道微生物群的影响，阐述其改善认知功能的机制，开发PSPs作为一种新的AD治疗候选药物提供数据支持。该研究从PSPs中分离纯化了一种单体多糖——PSP-1，以5xFAD小鼠为研究模型，评估其对记忆和认知等相关病理行为及肠道微生物指标的影响。研究成果以中南大学为通讯单位在国际期刊International Journal of Biological Macromolecules（Q1，IF=8.2）上发表了题为“A monomeric polysaccharide from Polygonatum sibiricum improves cognitive functions in a model of Alzheimer's disease by reshaping the gut microbiota”研究论文。

该研究首先对纯化得到了一种黄精单体多糖——PSP-1，并进行了初步鉴定（图1），证明该黄精多糖纯度和均匀性的优良。5xFAD小鼠作为典型的AD小鼠模型，在验证其肠道微生物群的动态变化与年龄有关后，确定对3个月大的小鼠开始给药PSP-1。对照组和实验组每天给予30 mg/kg的盐溶液和30 mg/kg的PSP-1溶液。处理3个月后，评估黄精多糖对小鼠记忆缺陷的改善作用，发现在Morris水迷宫测试中，经PSP-1处理后的5xFAD小鼠到达平台的延迟时间减少，即空间学习能力得到改善（图2B-C）；在探针试验中，经PSP-1处理的5xFAD小鼠在目标象限的时间百分比明显更高，并且更频繁地穿过目标象限，即空间记忆得到了恢复(图2D-F)。然后利用高尔基染色法和免疫化学染色法对5xFAD小鼠的突触丢失和Aβ沉积情况，即内在病理情况进行评估。发现经PSP-1处理后的5xFAD小鼠的脊柱密度明显恢复(图3A-B)，突触密度恢复(图3C-D)，脑部斑块沉积减弱(图3E-H)，脑裂解物中Aβ1-40和Aβ1-42的浓度也有显著降低(图3I)。另外，为了确认Aβ沉积情况改善机制，使用Aβ 6E10和Iba1抗体对脑切片进行免疫荧光染色，以及使用精氨酸酶-1抗体作为M2小胶质细胞的标记物对海马进行免疫荧光染色，结果均显示PSP-1处理显著增强了Aβ斑块周围小胶质细胞的募集（图4A-C），加强小胶质细胞从M1向M2表型的转变可能会潜在地减轻AD的病理损伤的论证。肠道菌群作为“微生物-肠道-脑”轴研究的关键节点。试验后续利用16S rRNA分析，对小鼠的肠道微生物组进行比对，发现PSP-1治疗后的小鼠螺杆菌数量明显下降（图5A-B），其中伤寒螺杆菌、幽门螺杆菌相对丰度减少，而嗜黏蛋白阿克曼菌和产酸拟杆菌则显著增长(图5E-H)，表明PSP-1能重塑微生物群以减轻5xFAD小鼠的肠道生态失调。最后，小鼠肠漏现象的改善，炎症因子的减少，杯状细胞的再生以及Aβ信号的显著降低共同表明了PSP-1可以保护了AD小鼠肠道屏障的完整性，减少肠道内Aβ的沉积（图6）。上述研究结果有助于更好地了解PSP-1对AD的改善作用，推进PSP-1的临床应用，拓展阿尔兹海默症的治疗手段！

图1 PSP-1的纯化及初步鉴定。

(A)在DEAE-52色谱柱上的分离洗脱图。(B)用Sephacry-200凝胶渗透色谱系统纯化和收集PSP-1。(C)PSP-1的紫外光谱。(D)PSP-1的红外光谱。(E)采用配备OHpak SB-803HQ、OHpak SB-804HQ和OHpak SE-805HQ (8 × 300 mm)串联柱的HPGPC系统测定PSP-1的分子量。(F)PSP-1的分子分布。

图2 PSP-1可改善5xFAD小鼠的记忆缺陷。

(A)PSP管理和行为评估联合方案的时间表。(B)PSP-1改善5xFAD小鼠的认知功能。WT和5xFAD小鼠(每组12只)口服药或PSP-1在水迷宫中训练5 d。(C)AUC潜伏期。(D)探针试验中停留在目标象限的时间百分比。(E)目标象限中的十字数。(F)探针试验中不同组泳道的代表性图像。(G)载药和PSP-1处理小鼠的游泳速度。数据以均数±SEM表示(*p < 0.05，**p < 0.01，#p < 0.001)，采用Tukey多重比较检验进行单因素方差分析。N = 12 /组)。

图3 PSP-1改善5xFAD小鼠突触丢失和Aβ沉积。

(A)高尔基染色显示CA1区树突层顶端的树突棘。标尺= 5 μm。(B)WT、载药和PSP-1处理的5xFAD小鼠脊柱密度定量分析(n = 5)。(C)突触结构代表性电镜图。箭头表示突触。标尺= 1 μm。(D)WT、载药和PSP-1处理的5xFAD小鼠(n = 5)突触密度的定量分析。(E)WT和5xFAD小鼠脑区海马淀粉样斑块的硫黄素-S染色。标尺= 100 μm。(F)淀粉样斑块定量分析。PSP-1可降低5xFAD小鼠脑内斑块密度(n = 5)。(G)WT和5xFAD小鼠脑额叶皮层淀粉样斑块免疫化学染色。标尺= 100 μm。(H)定量分析一半皮质斑块的平均数量(n = 5)。(I)载药和PSP-1处理5xFAD小鼠的Aβ1-40和Aβ1-42浓度(n = 3)。数据以均数±SEM表示(*p < 0.05，**p < 0.01, t检验)。

图4 PSP-1在体内促进斑块的小胶质细胞吞噬。

(A)载药和PSP-1处理的5xFAD小鼠皮层中Aβ斑块(6E10)和小胶质细胞(Iba1)共染色的代表性图像。标尺= 20 μm。(B)β斑块周围小胶质细胞的定量。采用双盲法，从每组3只小鼠中统计至少50个斑块。(C)Aβ斑块周围小胶质细胞的定量。Aβ斑块根据大小分为小、中、大。(D)载药和PSP-1处理5xFAD小鼠海马小胶质细胞(精氨酸酶-1)和小胶质细胞(Iba1)共染色M2表型的代表性图像。标尺= 20 μm。(E)显示了精氨酸酶-1和Iba1强度的定量(n = 5)。数据以均数±SEM表示(经t检验，*p < 0.05，**p < 0.01)。

图5 长期口服PSP-1后5xFAD小鼠粪便样品的16S rRNA分析。

(A)细菌属的相对丰度(n = 6 /组)。(B) ps -1处理后丰度变化最大的前10个属箱线图。不同组间微生物群落结构的α-多样性格局。(C)PCoA。(D)箱线图。(E-H)经指定处理的5xFAD小鼠粪便样品中4种细菌的相对丰度(n = 6)。数据以均数±SEM表示(*p < 0.05，**p < 0.01, n.s.表示无统计学意义，t检验)。

图6 PSP-1保护肠道屏障完整性，减少肠道Aβ沉积。

(A)通过FITC-葡聚糖易位测定的5xFAD小鼠胃肠道通透性屏障缺损(n = 4)。(B)PSP-1处理降低了TNFα和IL-6，但没有IL-1β的表达(n = 3)。(C)盲肠中occludin和ZO1的mRNA表达(n = 4)。(D)5xFAD盲肠中杯状细胞和Paneth细胞PAS染色的代表性图像。标尺= 100 μm。杯状细胞(E)和Paneth细胞(F)的定量。双盲法，每组3只小鼠，至少计数50个隐窝和绒毛。(G) 5xFAD小鼠结肠中Aβ和occludin的IF染色及定量。(H)(n = 4)，标尺= 100 μm。数据以均数±SEM表示(*p < 0.05， **p < 0.01, t检验)。