肠道健康对身体的新陈代谢、免疫力和精神状态产生重要影响。由于胃肠道中缺乏降解碳水化合物的活性酶，一些多糖很容易到达结肠，被肠道结肠微生物群发酵利用，从而保持微生态和肠道微生物群多样性的平衡。在肠道消化过程中，多糖会被结肠微生物群降解并利用，产生短链脂肪酸、益生元等物质，从而影响肠道微生物群的结构，促进宿主的健康。目前，关于黄精多糖（PCP）体外发酵过程中对人体肠道细菌和短链脂肪酸产生的调节的研究很少，有必要进一步研究PCP的潜在发酵机制及其对肠道细菌的调节作用。黄精是一种中药，已被列入药食同源植物。现代药理学研究表明，黄精具有降糖降脂、抗癌、抗炎抗菌、抗疲劳和免疫调节等药理作用。多花黄精（Polygomatum cyrtonema Hua）是中国药典中收录的黄精的三种基源植物之一。研究证实，黄精多糖（Polygonatum sibiricum polysaccharide，PSP）是其主要成分之一，由果糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和半乳糖醛酸组成，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗免疫调节等多种生物学特性。近年来，关于多花黄精多糖的结构性质和功能活性之间的研究层出不穷，然而对其结构特征的深入研究仍然有限。体外培养测定肠道菌的原理是利用发酵液营养成分的特性，通过体外培养方法，将肠道微生物从粪便等样本中分离培养出来，从而对其进行进一步的研究和分析。首先，与体内研究相比，体外微生物培养模型具有价格便宜、可重复、不需要伦理道德批准和实验时间短等优点。其次，体外培养方式在接种纯培养物或粪便悬浮液后，整个过程在无氧条件下进行，不控制pH值，具有速度快、成本低、操作简单、重现性好等一系列优点。此外，其高通量和自动化的特点，使其成为一个体外扩大化培养肠道菌群的有效方法。其应用主要包括肠道微生物的研究和肠道菌群的移植。在肠道微生物的研究中，体外培养模型可以帮助科学家了解肠道微生物的种类和特性，以及其与人体健康之间的关系。在肠道菌群的移植中，体外培养的方法可以用于获取用于移植的肠道菌群，从而探究体外培养的肠道菌群是否具有改善肠道微生态的有效性。近年来，越来越多的学者关注多糖及对肠道微生物的调节作用，多花黄精多糖构效有待进一步探明。近日，南昌大学余强教授团队，在International Journal of Biological Macromolecules(分区Q1,IF: 8.025)期刊上发表了题为发表了题为“Structural characterization and in vitro fermentation properties of polysaccharides from Polygonatum cyrtonema”的研究型论文。
本实验将新鲜样品根茎在沸水中烫2-3分钟并切片，然后在60℃下干燥，将干燥的根茎切片研磨成粉末并通过100目筛进行筛选，经水提醇沉后，将浓缩溶液装入透析袋，用去离子水进行透析（48小时），最后将透析液浓缩并冷冻干燥以获得黄精多糖（PCP-80%）。采用蒽醌-硫酸法测定总多糖含量，结果表明PCP-80%组分的总多糖含量为88.96%±0.60%。以半乳糖醛酸为参考，通过咔唑-硫酸法估算糖醛酸的含量，发现糖醛酸含量为2.91%±1.68%。以牛血清白蛋白为标准，采用Bradford法测定蛋白质含量，结果显示蛋白质含量为1.57%±0.02%。采用高效凝胶渗透色谱法（High-performance gel permeation chromatography，HPGPC) 和高效液相色谱系统测定PCP样品的分子量，结果显示PCP-80%是分子量为4.1 kDa的中性多糖，通过高效阴离子交换色谱法分析单糖组成，结果表明主要由果糖和葡萄糖组成，二者比例约为15:1。使用Nicolet 5700 FTIR光谱仪分析PCP样品的结构特征，结果表明PCP-80%具有典型的多糖化合物结构，同时具有吡喃糖和呋喃糖的构象（图1A）。使用X射线衍射仪在30 kV和20 mA下测定PCP-80%样品的结晶状态，结果表明PCP-80%表现出相对明显的宽晶体衍射峰，相对结晶度为26.87 %（图1B）。采用扫描电子显微镜观察多糖表面形态，发现PCP-80%主要是不规则的片状，表面光滑，结构多孔。使用热重量分析以对热稳定性进行分析，结果显示热解温度从30 ℃升到700 ℃，PCP-80%发生了热分解导致质量下降，在温度达到700 ℃时，PCP-80%的残留质量为20.56%，说明PCP-80%的热稳定性相对较好（图1C）。
图1 PCP-80%的FT-IR光谱（A），XRD谱图（B）和TGA图（C）。
为了确定多糖链的糖苷键，进行PCP-80%的甲基化分析，我们发现，PCP-80%中Fruf-(2→和→1)-Fruf-(2→残基含量最高，分别为27.62%和32.16%，Glcp-(1→是PCP-80%糖链的末端残基（表1）。表1 PCP-80%甲基化分析的GC-MS数据。
进一步采用核磁共振波谱分析，结果表明 PCP-80%主链可能由→1)-β-D-Fruf-(2→组成，支链以→6)-β-D-Fruf-(2→为主，包含一些→6)-β-D-Manp-(1→和α-D-Glcp-1末端残基（图2）。
图2 PCP-80 %的1H-1HCOSY (A)、HSQC (B)、HMBC (C)、NOESY (D)谱和部分结构片段（E）。
等量的新鲜粪便并与无菌磷酸盐缓冲液在厌氧条件下以1:10的比例混合，并通过无菌纱布过滤。随后，加入0.15g的PCP-80%混合在11mL的基础培养基和9mL的粪便中，37℃下孵育。通过高效液相色谱仪对pH值和短链脂肪酸进行测定，发现PCP-80%的添加能够降低肠道环境pH，促进乙酸、丙酸和正丁酸等短链脂肪酸的产生（表2）。表2 不同发酵时间点产生短链脂肪酸的含量和pH值变化。
使用Mag-Bind土壤DNA试剂盒分离粪便微生物基因组DNA，PCR扩增和测序后进行聚类分析。通过Chao1指数、Simpson指数、Observed指数和Shannon index，发现PCP-80%对肠道微生物的影响，在发酵6 h时，PCP-80%组中肠道细菌群落的丰富度和多样性显著降低，即补充PCP-80%可能会导致某些特定细菌的数量增加，进而降低了肠道菌群的多样性和丰富度（表3）。PCP-80%能够提高Megamonas、Bifidobacterium和Phascolarctobacterium等有益菌属的相对丰度，从而提高益生活性（图3）。表3 不同时间点PCP-80 %发酵液的Alpha多样性指数变化。
图3 PCP-80 %组在门水平（A）和属水平（B）上的微生物群落相对丰度。
综上，多花黄精多糖均一组分PCP-80%相对分子量为4.1 kDa，主要由果糖和葡萄糖组成，其部分结构可能是以→1)-β-D-Fruf-(2→为主链，侧链主要由→6)-β-D-Fruf-(2→组成。体外结肠发酵过程中，添加PCP-80%可降低肠道环境的pH值，促进短链脂肪酸的产生，增加Megamonas、Bifidobacterium和Phascolarctobacterium等有益菌的相对丰度，从而改变肠道菌群的组成。本研究通过分级醇沉法从多花黄精的干燥根茎中获得了纯多糖组分（PCP-80%），并通过单糖组成、傅立叶红外光谱、扫描电子显微镜观察、甲基化分析和核磁共振光谱对其化学结构进行了表征。在此基础上，通过体外模拟结肠发酵模型研究了PCP-80%对粪便微生物群落结构和短链脂肪酸产生的影响。该研究有助于丰富多花黄精多糖结构特性的研究信息，并为其他黄精的探索提供理论参考。同时有助于揭示多花黄精多糖的益生作用，扩大多花黄精多糖资源的应用。
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